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本试剂盒采用优化的碱裂解法配合硅胶膜吸附技术特异性结合质粒，独特设计的溶液系统去除了杂质、蛋白和内毒素，配合内毒素清除剂进一步将内毒素选择性清除到最低限度，除用于常规的PCR、酶切、测序、转化等实验外，还可以直接用于原生质体转染和真核细胞转染等实验。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，从1.5～5mL大肠杆菌LB（Luria-Bertani）培养液中，可快速提取多达20～50μg纯净的高拷贝质粒DNA。
  
• 独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

• 内毒素清除剂常温运输，4℃可以保存12个月。
  
• RNaseA保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。
  
• 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的RNaseA加入溶液P1后置于4℃可保存3个月左右。如果溶液P1中RNaseA时间较久失活了，提取的质粒可能有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNaseA即可。
  
• 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

• 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12000rpm的台式离心机。
  
• 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、N3的用量。
  
• 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mlDNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本试剂盒正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
  
• 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶和去蛋白液PE瓶中按标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 将RNaseA全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2～8℃保存。

• 取1.5～5mL过夜培养的菌液加入1.5mL离心管，12000rpm离心30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。
  
  • 如使用收集超过1.5mL菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
• 加250μL溶液P1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
  
  • 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 加250μL的溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，室温放置4～5min。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
• 加250μL溶液N3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，小心吸取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
  
  • 加入溶液N3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
• 柱平衡：向吸附柱AC中加入100μL平衡液，12000rpm离心1min，弃滤液，备用。
  
  • 平衡液可以增强硅胶膜的吸附核酸能力，请使用当天处理的吸附柱。
• 加入0.1体积(上清的体积的10%，约75μL)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀。
  
• 向上一步得到的混合液中加入0.5倍体积异丙醇（约370μL）后充分颠倒混匀后，分多次转移混合液至吸附柱AC中，12000rpm离心1min，弃滤液。
  
• 加入500μL去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。
  
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。再加入600μL漂洗液WB重复漂洗一次，弃滤液。
  
• 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL～100μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在80℃～90℃水浴中预热可提高产量），室温放置2min，12000rpm离心1min，弃吸附柱。
  
  • 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于30μL）。

• 接前面操作步骤6，将加入0.1体积(上清的体积的10%，约75μL)的内毒素清除剂混匀后的上清，冰浴(或放入冰箱冷冻室)5min直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间可以充分颠倒混匀1次。
  
  • 内毒素清除剂加入上清后，可能会短暂浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。
• 常温放置3～5min，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
  
  • 如室内温度较低或想加快速度可以在37～42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。
• 室温12000rpm离心10min分相。上层水相含质粒DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
  
• 向第3步得到的上清中加入0.5倍体积异丙醇（约370μL）后充分颠倒混匀后接前面操作步骤7分多次转移混合液至吸附柱AC中，完成后续操作步骤。